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Jun 04, 2023

Efecto de la fucosilación del núcleo de Fc y el isotipo de cadena ligera sobre la flexibilidad de IgG1

Communications Biology volumen 6, Número de artículo: 237 (2023) Citar este artículo 847 Accesos 3 Detalles de Altmetric Metrics La N-glicosilación juega un papel clave en la modulación de la bioactividad de monoclonales

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 237 (2023) Citar este artículo

847 Accesos

3 altmétrico

Detalles de métricas

La N-glicosilación juega un papel clave en la modulación de la bioactividad de los anticuerpos monoclonales (mAb), así como el isotipo de cadena ligera (LC) puede influir en sus propiedades fisicoquímicas. Sin embargo, investigar el impacto de tales características en el comportamiento conformacional de los mAb es un gran desafío, debido a la altísima flexibilidad de estas biomoléculas. En este trabajo investigamos, mediante dinámica molecular acelerada (aMD), el comportamiento conformacional de dos inmunoglobulinas comerciales G1 (IgG1), representativas de los anticuerpos κ y λ LCs, tanto en su forma fucosilada como afucosilada. Nuestros resultados muestran, a través de la identificación de una conformación estable, cómo la combinación de fucosilación e isotipo LC modula el comportamiento de bisagra, la conformación de Fc y la posición de las cadenas de glucano, todos factores que potencialmente afectan la unión a los FcγR. Este trabajo también representa una mejora tecnológica en la exploración conformacional de mAb, lo que convierte a la AMD en un enfoque adecuado para aclarar los resultados experimentales.

La mayoría de los anticuerpos monoclonales (mAb) clínicamente disponibles son inmunoglobulina G1 (IgG1)1, debido a su mayor estabilidad y potentes funciones efectoras con respecto a otras subclases de IgG. Los mAb se componen de tres dominios: dos fragmentos de dominios de unión a antígeno (Fab) y un fragmento cristalizable (Fc), que incluyen cadenas pesadas y ligeras (HC y LC, respectivamente), y ambos contienen regiones variables y constantes. Los dominios variables son responsables de la respuesta inmune adaptativa o, en el caso de los mAb comerciales, de unirse selectivamente a un antígeno diana. Los anticuerpos pueden presentar dos isotipos diferentes de LC, a saber, κ y λ2. La proporción de anticuerpos que contienen LC κ o λ varía considerablemente entre especies3 y, considerando los ~ 100 mAb terapéuticos aprobados, solo unos pocos contienen un LC4 λ. Se publican pocos estudios sobre la comparación funcional y estructural entre estos dos isotipos, lo que sugiere diferencias en la cooperatividad y flexibilidad de los dominios Fab5, y en las propiedades estructurales de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR)6. La capacidad de las IgG1 para activar el sistema inmunológico mediante la interacción del Fc con receptores Fcγ específicos (FcγR) se considera un aspecto clave regulado también por la N-glicosilación sobre el Asn297 conservado en el Fc7,8. La alteración en la longitud, composición y carga de los glicanos puede afectar la integridad estructural y la conformación del dominio Fc, cambiando así la afinidad de unión a los FcγR e influyendo en la respuesta inmune9,10. En particular, la fucosilación del núcleo puede afectar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), ya que disminuye la afinidad de unión de la IgG1 al FcγRIIIa (un receptor activado de baja afinidad)1,11,12,13,14,15,16. 17.

A pesar de estas observaciones, nunca se ha investigado el papel estructural de las diferencias de LC en la modulación del comportamiento funcional de estas biomoléculas, tanto en términos de reconocimiento de antígenos como de activación de la función efectora. Algunos estudios18,19 han propuesto hipótesis para explicar el efecto de la fucosilación sobre las funciones efectoras, pero centrándose únicamente en el Fc sin considerar el papel de los dominios bisagra y Fab. En nuestro trabajo anterior20, propusimos que la presencia de fucosa puede modular el comportamiento conformacional de todo el mAb induciendo una preferencia por una conformación en forma de T, en principio menos adecuada para la unión al receptor. De acuerdo con nuestros resultados anteriores, Spiteri et al. han demostrado cómo los glicanos pueden introducir limitaciones estructurales, mediante una comparación de IgG1 glicosilada y aglicosilada. Este trabajo muestra que la eliminación de glicanos afecta la separación Fab-Fc, al modular la flexibilidad de la proteína, permitiendo que el anticuerpo explore un espacio conformacional diferente e impactando la unión a FcγRs21. En este trabajo, investigamos el papel de la fucosa y de los dos isotipos LC en el comportamiento estructural de las IgG1, utilizando un innovador enfoque in silico para mAbs, basado en una combinación de simulaciones de dinámica molecular clásica y acelerada (cMD y aMD, respectivamente). ). Se llevó a cabo una comparación entre las formas afucosilada (G0) y ​​fucosilada (G0F) de adalimumab y avelumab, dos IgG1 comerciales que son buenos modelos de anticuerpos κ y λ LC, lo que sugiere un papel clave de λ LC en la modulación de la dinámica de IgG1. Hasta donde sabemos, la combinación de métodos MD de muestreo estándar y mejorado nunca se ha utilizado en el contexto del comportamiento conformacional de los mAb. En consecuencia, nuestros resultados pueden allanar el camino hacia nuevas perspectivas futuras (experimentales y computacionales) en la investigación de la flexibilidad de los anticuerpos.

Se construyeron modelos quiméricos 3D para adalimumab y avelumab, elegidos como buenos modelos de isotipos κ y λ, como se describe en la sección Materiales y métodos. La selección de estos dos mAb comerciales como estudio de caso se realizó de acuerdo con una alineación de secuencia que se muestra en el Material complementario (Figura 1 complementaria). Se obtuvieron y simularon mediante cMD dos modelos afucosilados (adalimumab G0, avelumab G0) y ​​dos fucosilados (adalimumab G0F, avelumab G0F) para un total de 3 µs (tres réplicas de 1 µs de longitud). En la figura complementaria 2 se presenta una representación esquemática de los glicanos utilizados en este estudio, de acuerdo con el esquema de nomenclatura de símbolos para glicanos (SNFG)22. En estos sistemas, la presencia de la región bisagra, un enlazador flexible que conecta todos los dominios dejando al menos cuatro grados de libertad (θ y ϕ para cada Fab), evita la convergencia de la desviación cuadrática media (RMSD) y la fluctuación RMS ( RMSF), que resultan poco informativos. En las figuras complementarias. 3-5 se presentan, respectivamente, los gráficos RMSD, RMSF y Rg calculados para los átomos de C-alfa, lo que muestra que todos los sistemas salen del estado de alta fluctuación de los parámetros geométricos después de 300 ns de cMD, incluso si ninguno de ellos alcanza un pozo. -estado de meseta definido de estos descriptores. En consecuencia, el análisis se centró en la variación del ángulo θ en los últimos 7000 fotogramas. Este ángulo, como ya se mostró20, representa la propensión de los dominios Fab a acercarse a Fc, lo que permite la clasificación de conformaciones en forma de Y (θ < 85 °) o T (θ ≥ 85 °). La Figura 1a muestra una clara tendencia de G0F adalimumab a permanecer en una conformación en forma de T, ya que durante el 30% del tiempo ambos Fab presentan θ ≥ 85°. Esta tendencia se invierte en G0 adalimumab que hasta el 50% del tiempo tiende a adoptar una conformación en forma de Y. Por el contrario, avelumab no muestra diferencias significativas entre las especies G0 y G0F, pero ambas parecen preferir una orientación en forma de Y. Además, todos los biopolímeros estudiados presentan un comportamiento asimétrico, con una distribución diferente de los valores de θ asumidos por dominios Fab individuales a lo largo de la trayectoria (Fig. 1b). Estas características conformacionales se señalaron mediante un análisis de conglomerados que muestra una conformación clara en forma de Y para adalimumab G0, avelumab G0 y G0F, y una conformación en forma de T para adalimumab G0F (Fig. 1c).

a Gráfico de barras que muestra el porcentaje de fotogramas en los que θ ángulos de ambos dominios Fab presentan valores ≥ o <85° simultáneamente. b Gráfico de barras que muestra el porcentaje de fotogramas en los que el ángulo θ de cada dominio Fab es ≥85°. c Medoides del grupo más poblado identificados para cada mAb con los valores de θ correspondientes. d Gráficos de caja de la distribución de distancia de los dominios CH2 para cada mAb. Los gráficos que se muestran en (a, byd) se generaron fusionando tres réplicas para cada sistema con n = 21.000 fotogramas para cada condición.

De acuerdo con la evidencia de que la presencia de una conformación Fc abierta o cerrada puede asociarse con una mayor o menor afinidad de unión a FcγR23, se reporta un análisis de la distancia entre dominios CH2. Los resultados (Fig. 1d) muestran que adalimumab G0F tiene una distancia menor en términos de valor mediano (3,1 nm) y, por lo tanto, un dominio Fc cerrado que adalimumab G0 (4,8 nm), como se informó en nuestro trabajo anterior20. En cambio, las especies de avelumab muestran distribuciones muy similares, con valores medios de 3,7 nm (G0) y ​​4,1 nm (G0F), comparables a los de adalimumab G0, lo que respalda la hipótesis de comportamientos muy similares de las formas de avelumab. Sin embargo, como se muestra en los siguientes párrafos, la cMD no fue lo suficientemente eficiente para explorar el espacio conformacional de las λ LC IgG1.

Para explorar y caracterizar más a fondo el comportamiento conformacional de todas las especies investigadas, se llevaron a cabo simulaciones AMD de 1 μs de longitud. Con este método se añade un potencial de polarización al sistema, perturbando tanto la energía potencial como los ángulos diédricos, y acelerando los cambios conformacionales. Este método permite la exploración de una región más amplia de la superficie de energía libre (FES) de la molécula en comparación con una cMD, permitiendo así también muestrear estados conformacionales no observados con las simulaciones de cMD.

Se calculó el perfil de energía libre a lo largo de Theta1 (ángulo θ entre Fab1 y Fc) y Theta2 (ángulo θ entre Fab2 y Fc) para obtener la fuerza promedio de todas las configuraciones posibles de cada sistema (Fig. 2). Este análisis permitió identificar una región del FES con un valor mínimo de potencial de fuerza media (PMF < 0,5 kcal/mol). Los resultados de adalimumab G0 y G0F confirman el comportamiento observado con cMD, con una conformación en forma de Y preferida para adalimumab G0 (θ ≈ 70° para ambos Fab) y una conformación en forma de T para adalimumab G0F (θ > 90° para ambos Fab). ), como se muestra en la Fig. 2. Por el contrario, tanto G0 como G0F avelumab son propensos a alcanzar una conformación en forma de T, con θ > 90° en al menos un Fab en G0 avelumab, y en ambos dominios Fab en G0F avelumab. . Según este análisis, el papel de la fucosa en la promoción de la conformación en forma de T se confirma para ambos isotipos. Por otro lado, se descubre un supuesto papel de λ LC en la promoción de una conformación en forma de T, incluso en ausencia de fucosa. Además, especialmente para avelumab, estos resultados resaltan claramente el límite de los métodos cMD para explorar grandes espacios conformacionales de tales proteínas flexibles. Al mismo tiempo, AMD se abre a la identificación de otros descriptores que permitan una investigación exhaustiva del comportamiento conformacional. A partir de estos resultados, dado que el alcance de las simulaciones AMD era identificar estructuras de mínima energía, los siguientes análisis se centraron en los marcos y las correspondientes conformaciones incluidas en el mínimo de energía identificado.

El perfil de energía libre (después de reponderar) de los cuatro anticuerpos a lo largo de los ángulos Theta1 y Theta2 con la superficie molecular de las estructuras medoides aisladas de la región de energía mínima (en rojo oscuro) mediante análisis de conglomerados. La barra de color representa el valor de PMF en kcal/mol. Los círculos discontinuos negros muestran el espacio conformacional explorado con simulaciones de CMD, que para avelumab es limitado con respecto al muestreado mediante AMD.

Entre los diversos descriptores que utilizamos para analizar el comportamiento de los mAb simulados, se calcularon los ángulos ϕ para describir los movimientos de rotación de los dominios Fab. Δϕ se calculó para determinar el desplazamiento de cada Fab con respecto a su posición inicial, como se formaliza en la ecuación. (1).

donde i es el i-ésimo cuadro de la trayectoria y 0 es el cuadro inicial.

En consecuencia (Fig. 3), mientras que en los anticuerpos κ hay solo un pequeño desplazamiento de los dominios Fab, los λ Fab muestran una mayor susceptibilidad a rotar (al menos 100° de desplazamiento) incluso si es asimétrica. Se realizó una dinámica esencial en las trayectorias generales para explicar la diferente propensión rotacional de los dos isotipos. Este análisis mostró que adalimumab y avelumab se ven afectados por diferentes movimientos principales y, al calcular el Δϕ a lo largo de la dirección de los dos primeros vectores propios, la distribución de este valor es comparable a la calculada en toda la trayectoria. Esto sugiere que la diferente propensión rotacional es una propiedad intrínseca de los dos isotipos. En la figura complementaria 6 se presenta el gráfico de PC normalizado, que muestra la importancia estadística de considerar los dos primeros vectores propios.

Distribución Fab1 y Fab2 Δϕ en κ (a) y λ (b) mAb calculadas para los fotogramas en el mínimo de energía y a lo largo de la dirección de los dos primeros vectores propios aislados de las trayectorias completas. Los gráficos de densidad muestran cómo en cada anticuerpo hay al menos un vector propio que puede explicar las rotaciones de los dominios Fab.

También se identificó un comportamiento diferente entre κ y λ en el contexto de los descriptores Fc. Al calcular la distancia entre los dominios CH2 (Fig. 4a), en cuanto a las simulaciones de cMD, se observó que mientras los κ mAb prefieren una conformación Fc abierta con valores de distancia CH2 que oscilan globalmente entre 4 y 6 nm, los λ prefieren una estructura Fc cerrada. , con distancias de CH2 entre 2 y 4,5 nm. Además, los resultados muestran que el dominio Fc tiende a permanecer en una conformación más cerrada en especies G0F que en G0, de acuerdo con lo reportado previamente20. Estos datos están alineados con el análisis de la distancia mínima entre las cadenas de carbohidratos informado en la Fig. 4b, que muestra que, independientemente del isotipo LC, los glicanos fucosilados permanecen dentro de la cavidad Fc, promoviendo la conformación cerrada de Fc. Por otro lado, los glucanos G0 prefieren permanecer fuera del Fc y bien distanciados. En la Fig. 4c, se informa que las estructuras medoides de los dominios Fc resaltan la posición de los glicanos con respecto a la cavidad Fc.

Gráfico de densidad de la distribución de distancia de CH2 (a) y de la distancia mínima entre cadenas de glicano (b) para cada mAb. c Superposición estructural de estructuras Fc representativas aisladas de medoides, que muestran la diferente posición de los glicanos G0 (internos) y G0F (externos).

Según los resultados descritos anteriormente, se han observado dos efectos que modulan el comportamiento de los anticuerpos: el “efecto LC”, que influye principalmente en la rotación Fab y la apertura Fc, y el “efecto fucosilación”, con impacto principal en la Y/T. -Conformación en forma y posición de los glicanos dentro/fuera de la hendidura Fc. Teniendo en cuenta el papel fundamental de la región bisagra en la flexibilidad de los mAb, para investigar el "efecto LC", se determinaron los contactos entre los átomos pesados ​​de los últimos seis (para adalimumab)/siete (para avelumab) residuos C-terminales de LC y la bisagra. calculado, mostrando una actitud diferente de los dos isotipos al hacer contactos con la bisagra, debido a la diferencia en la composición de la secuencia. Los resultados muestran que adalimumab G0 (Fig. 5a, panel izquierdo) realiza un mayor número de interacciones que avelumab G0 (Fig. 5b, panel izquierdo), con un papel clave de Arg211, probablemente debido a las características de las sustituciones en esta región ( Figura complementaria 1) y a la inserción de Ser216 en λ LC. En cambio, considerando los anticuerpos G0F, el efecto de la fucosilación se traduce en un número creciente de contactos para ambos mAb, especialmente en los últimos 2-3 residuos, que para adalimumab incluyen Glu213 y Cys214 (Fig. 5a, panel derecho), mientras que para avelumab Glu214, Cys215 y Ser216 (Fig. 5b, panel derecho). A diferencia de las especies G0, la combinación de LC y efectos de fucosilación es seguida por un fuerte aumento en el número de contactos realizados por Ser216 en G0F avelumab, lo que sugiere tanto una susceptibilidad de este residuo a la presencia de fucosa como un papel en la modulación de la flexibilidad de la bisagra. En la Fig. 5c se informa una representación esquemática de la proximidad estructural entre los residuos de LC C-terminales y la bisagra en los anticuerpos G0, mientras que en la Fig. 7 complementaria se muestra la representación de los mAb G0F. A nivel mundial, el menor número de contactos entre la LC C-terminal y la bisagra observada en avelumab también podría respaldar la diferente propensión rotacional (Δϕ) de las dos especies de anticuerpos, un aspecto que se investigará más a fondo en el futuro.

Diagramas de caja que muestran la distribución del número de contactos entre los residuos de LC C-terminal y la bisagra en adalimumab (a) y avelumab (b). El número de fotogramas considerados en estos análisis es: n = 2649 para adalimumab G0, n = 3440 para adalimumab G0F, n = 3170 para avelumab G0, n = 4110 para avelumab G0F. Representación estructural de G0 adalimumab (c) y avelumab (d) para resaltar la proximidad estructural entre los residuos de LC C-terminales y la bisagra. La estructura secundaria de los dominios Fab se muestra como líneas, los residuos de LC se muestran como barras y la superficie molecular de la bisagra se muestra en gris. Para mayor claridad, no se muestra Fc.

Para evaluar el efecto de la fucosilación, se calcularon las interacciones de los enlaces H entre los glicanos y el anticuerpo correspondiente. En las Figs. 6–7 (paneles A). Este análisis muestra que (i) las cadenas G0F hacen más contactos que las G0; (ii) al contrario de lo observado para las interacciones de átomos pesados, los glicanos G0 en avelumab hacen más contactos que en adalimumab y algunos de estos enlaces involucran residuos LC, a saber: Lys153, Gly156 y Thr209; (iii) en ambos mAb G0F, los glicanos realizan interacciones directamente con la bisagra (avelumab) o con residuos cercanos (adalimumab), lo que respalda nuestra hipótesis de que, al modular la flexibilidad de la bisagra, la fucosa introduce una restricción estructural y aumenta la preferencia por una forma de T. conformación. En las Figs. 6-7 (paneles B), se muestra un resumen de las interacciones más relevantes entre los glicanos y los anticuerpos, con especial atención a los residuos de LC (G0 avelumab) y los de bisagra. Las tablas complementarias 1 a 4 informan todas las interacciones encontradas con la frecuencia asociada en los marcos de energía mínima.

Un gráfico de puntos que muestra las interacciones específicas realizadas por las cadenas G0 y G0F con adalimumab con un código de color específico para HC1, HC2 y LC1. Representación estructural de los enlaces H más relevantes identificados entre los azúcares y G0 (b) y G0F (c) adalimumab. La estructura secundaria se muestra como cintas, los residuos principales como barras amarillas y la superficie molecular de los azúcares se muestra en gris y rojo oscuro (fucosa).

Un gráfico de puntos que muestra las interacciones específicas realizadas por las cadenas G0 y G0F con avelumab con un código de color específico para HC1, HC2 y LC2. Representación estructural de los enlaces H más relevantes identificados entre los azúcares y G0 (b) y G0F (c) avelumab. La estructura secundaria se muestra como cintas, los residuos principales como barras amarillas y la superficie molecular de los azúcares se muestra en gris y rojo oscuro (fucosa).

Se realizó un análisis de variabilidad conformacional de las cadenas de azúcar para todos los sistemas simulados considerando los marcos energéticos mínimos. Primero, dado que se utilizó un método de muestreo mejorado, como el AMD, se verificó el muestreo de los ángulos diédricos φ y ψ correctos identificados para cada pareja de azúcares. Los ángulos se identificaron según la definición reportada por Wormald MR y colegas24. Higos suplementarios. 8-10 informan la distribución de los valores diédricos para cada par de azúcares en los sistemas G0 y G0F en comparación con los valores obtenidos de estructuras de glicoproteínas resueltas experimentalmente24. En consecuencia, en todos los sistemas, el muestreo de los diedros es consistente con su rango permitido. Este resultado valida el uso de AMD con campo de fuerza CHARMM36 para los glicanos investigados en este trabajo. Para evaluar más a fondo la posición de los glicanos en conformaciones en forma de Y y T, se calculó la distancia entre el centro de masa (com) de cada cadena de glicanos y ella misma con respecto a la posición Fc. La distribución de los valores de distancia se muestra en la Fig. 11 complementaria y confirmó lo que ya se observó con la distancia mínima calculada entre las cadenas de glucano A y B en cada anticuerpo (Fig. 4b): las cadenas G0 son más flexibles que las G0F y exploran una conformación más grande. espacio, como lo señalan los valores de distancia más altos. Además, en avelumab el comportamiento de los dos oligosacáridos es ligeramente más similar, lo que sugiere una menor flexibilidad también para las cadenas G0, lo que probablemente se debe a la conformación en forma de T que asume el anticuerpo incluso en presencia de glicanos G0. Este análisis se integró aún más con un análisis de conglomerados útil para describir la dinámica de los azúcares. Las cinco estructuras de glucano más representativas identificadas para cada cadena en cada anticuerpo se informan en la Figura complementaria 12 con el porcentaje de población del grupo asociado. Como resultado, todos los glicanos muestran una cierta variabilidad entre los grupos, lo que sugiere, como era de esperar, una mayor flexibilidad de estas moléculas con respecto a la proteína. Por otro lado, este análisis confirma que los glicanos están fuera o dentro de la cavidad Fc en función de la ausencia o presencia de fucosa, respectivamente, y no en función de la forma del anticuerpo, Y o T. Además, si en adalimumab el comportamiento de G0 y Los glicanos G0F parecen influir también en la diferente forma del anticuerpo; en avelumab estos aspectos son independientes. De hecho, G0 avelumab asume una conformación en forma de T incluso si los glicanos tienden a permanecer fuera del Fc, lo que sugiere, de otra manera, el papel del isotipo LC en la modulación de la dinámica de los anticuerpos.

Nuestro objetivo era investigar mediante métodos in silico el comportamiento de la IgG1 terapéutica con LC κ y λ, identificando características estructurales útiles para predecir su comportamiento conformacional y bioactividad, y por primera vez una estructura energética mínima. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio in silico destinado a comparar estos dos isotipos de IgG1, considerando ambos las proteínas de longitud completa y combinando diferentes enfoques de MD: simulaciones de cMD y AMD. Se investigaron dos representantes de las LC IgG1 κ y λ, adalimumab y avelumab, en sus formas G0 y G0F, y se observaron dos efectos que impactan la flexibilidad de los mAb: el “efecto de fucosilación”, que ya ha sido ampliamente descrito1,11,12 ,13,15,16,17, y el “efecto LC” que informamos aquí por primera vez. Como ya planteamos la hipótesis en nuestro trabajo anterior20 y en línea con el papel de la glicosilación en la influencia de la flexibilidad de IgG1 demostrado por Spiteri et al.21, el "efecto de fucosilación" impacta en la preferencia de conformación en forma de Y/T y en la posición de los glicanos. dentro/fuera del Fc. En cambio, se descubrió que el "efecto LC" modula la rotación Fab y la apertura Fc, además de contribuir a la estabilidad de la conformación en forma de Y/T, lo que sugiere otro actor en las características conformacionales de estas biomoléculas. Ambos efectos actúan contra la flexibilidad de la bisagra, siendo críticos para la propensión conformacional del anticuerpo. Con base en los resultados, podemos resumir que: (i) considerando las formas G0, mientras que en adalimumab la LC puede interactuar con la bisagra modulando su flexibilidad, en avelumab estas interacciones faltan debido a las diferencias en la composición de aminoácidos. Esto se traduce en una propensión rotacional Fab diferente de los dos isotipos (distribución del ángulo Δϕ); (ii) considerando las formas G0F, en ambos anticuerpos hay un aumento del número de interacciones tanto entre LC y bisagra como entre azúcares y la proteína. Las cadenas de azúcar G0F interactúan directamente con la bisagra o con los residuos cercanos, introduciendo una restricción estructural en la molécula. Esto confirma el efecto ya hipotetizado mediado por la fucosa sobre la flexibilidad de la bisagra; (iii) el efecto de la fucosa está presente independientemente del isotipo LC, pero en G0F avelumab se potencia porque se combina con el efecto de λ LC, debido al aumento en el número de contactos entre el C-terminal Cys214, Glu215 y Ser216 y la bisagra; (iv) el "efecto LC" contribuye fuertemente al comportamiento conformacional de G0 avelumab, donde los residuos de LC están involucrados en interacciones con azúcares y no con la bisagra como ocurre con adalimumab. Esto respalda la hipótesis de que las diferencias en la composición de la secuencia de LC podrían afectar el comportamiento de IgG1, promoviendo una conformación en forma de T y probablemente reduciendo la afinidad de λ LC IgG1 por FcγRIIIa. En consecuencia, nuestra hipótesis es que el impacto de la fucosilación en la actividad ADCC de λ LC IgG1 podría ser menor que el de κ LC IgG1. Nuestros resultados sobre el efecto LC, de hecho, concuerdan fuertemente con el estudio experimental publicado por Shen et al.25. Después de la eliminación del Ser C-terminal en λ LC, que falta en κ, los autores observaron no sólo un aumento en la estabilidad de la molécula a valores de pH altos, sino también un aumento en la respuesta de ADCC, lo que sugiere que la presencia de este Los residuos pueden comprometer la funcionalidad de IgG1. Por otro lado, el papel estructural de la fucosa en la modulación de la preferencia de IgG1 por una conformación en forma de T, que ya habíamos planteado como hipótesis20, fue confirmado y explicado aún más por las interacciones entre los azúcares y la bisagra. La implementación de AMD, de hecho, nos permitió explorar regiones del anticuerpo FES y conformaciones que no se observan con los métodos clásicos.

La combinación de cMD y aMD representa una gran mejora en la comprensión profunda de los mecanismos moleculares que regulan el comportamiento conformacional de esta clase de moléculas. Este enfoque, que nunca se ha utilizado en el contexto de los mAb, podría implementarse aún más para aumentar la base de conocimientos sobre la eficacia y la estabilidad de los mAb y respaldar mejor los hallazgos sobre el mecanismo de acción de esta clase de bioterapéuticos.

Este estudio también sienta las bases de nuevos enfoques para la modulación de la dinámica de IgG1, abriendo nuevas perspectivas en el contexto de la ingeniería genética aplicada al desarrollo de anticuerpos. Nuestros resultados, de hecho, señalan la relevancia de considerar cuidadosamente el isotipo LC en el desarrollo de nuevos bioterapéuticos. Los futuros enfoques de diseño de proteínas in silico y experimentos de mutagénesis serán útiles para validar el papel de la LC en la flexibilidad y actividad de los anticuerpos.

Para identificar buenas plantillas para nuestro propósito, se realizó una alineación de secuencia entre 20 κ cristalizados humanos, 16 λ cristalizados humanos y 26 IgG1 completamente humanas comercializadas (21 κ y 5 λ) (Nota complementaria 1 y Figura complementaria 1). Los dominios Fab de IgG1 cristalizados humanos se seleccionaron mediante la herramienta “Buscador de anticuerpos” incluida en MOE 2020.0126, mientras que las moléculas comercializadas se seleccionaron del sitio web “The Antibody Society27” y sus secuencias primarias se importaron de DrugBank28. Se utilizó la herramienta "Protein Align" de MOE para realizar la alineación de secuencias múltiples utilizando una matriz BLOSUM62.

Los modelos atomísticos de adalimumab y avelumab se construyeron con el mismo enfoque de modelado de homología quimérica mediante la herramienta "Modelo de homología" del software MOE26. Las estructuras cristalográficas de los dominios Fab de adalimumab y avelumab están disponibles (PDB ID: 3WD5 y 4NKI, respectivamente)29,30 y se usaron para modelarlos, mientras que la única estructura resuelta de una IgG1 humana completa se usó como plantilla (PDB ID : 1HZH)31 para construir las porciones de bisagra y Fc. La estructura de 1HZH que elegimos es la contenida en la biblioteca MOE de anticuerpos cristalizados, que ha sido procesada por expertos del MOE con simulaciones de MD. Esta elección deriva de la necesidad de utilizar la misma conformación inicial de los anticuerpos para señalar diferencias mediadas por glicanos. Antes de realizar el modelado de homología, todas las plantillas se prepararon utilizando la herramienta "Structure Preparation" de MOE, para corregir cualquier problema cristalográfico, y se procesaron con la herramienta "Protonate 3D" para asignar los estados de ionización y agregar los hidrógenos faltantes. Tanto la estructura 3WN5 como la 4NKI presentan algunos residuos omitidos. Los últimos tres residuos C-terminales en LC de 3WD5 (Gly212, Glu213 y Cys214) se modelaron en 1HZH.pdb con la opción "anular plantilla" habilitada. En 4NKI, se omitieron el primer (Gln1) y los últimos tres (Glu214, Cys215 y Ser216) aminoácidos de la LC. Gln1 fue agregado y minimizado manualmente a través de la herramienta "Protein Builder" de MOE, Glu214 y Cys215 se modelaron en 1HZH.pdb para preservar su orientación con la opción "anular plantilla" habilitada. Se agregó Ser216 una vez construido el modelo quimérico y minimizado junto con el enlace disulfuro adyacente, para preservar la estabilidad de la estructura aglicosilada.

Luego los modelos fueron glicosilados. Como se informó anteriormente20, los azúcares G0 y G0F fueron unidos unidad por unidad al Asn297 conservado de adalimumab (Asn301) por el “constructor de carbohidratos” del Ministerio de Educación. Se llevó a cabo un paso de minimización final en modelos glicosilados completos hasta que el gradiente RMS alcanzó 0,01 kcal/mol/Å2. Para avelumab, los glicanos G0F, ya presentes en la plantilla 1HZH de la biblioteca MOE, se vincularon al Asn297 (Asn300) conservado después de la superposición estructural y la energía se minimizó hasta un gradiente RMS de 0,01 kcal/mol/A2. Para construir los modelos G0, se eliminó la fucosa de las cadenas de glucano en los modelos G0F, luego se minimizó nuevamente la energía de los glucanos y Asn297 hasta un gradiente RMS de 0,1 kcal/mol/A2.

Se llevaron a cabo tres simulaciones de cMD de 1 µs para cada modelo (adalimumab G0 y G0F, avelumab G0 y G0F) utilizando AMBER2032 como motor de integración y AMBER10:EHT forcefield33, para un total de 3 µs de tiempo simulado por cada anticuerpo. Dos de cada tres simulaciones MD de adalimumab ya se habían realizado en nuestro trabajo anterior20, por lo que se volvieron a analizar y se calculó una tercera réplica según el mismo protocolo. Más específicamente, los sistemas fueron configurados por MOE y solvatados con el modelo de agua TIP3P y NaCl 0,1 M. Se aplicó el termostato Langevin para el control de temperatura, el barostato Monte Carlo se usó para establecer una presión constante y las simulaciones se llevaron a cabo en el conjunto NPT ( T = 300 K, P = 100 kPa). El tiempo de muestreo se estableció en 10 ps y el paso del tiempo de integración en 2 fs. Los sistemas se minimizaron durante 5000 pasos y se realizó una fase de calentamiento durante 100 ps. Luego, antes del paso de producción se llevó a cabo una fase de equilibrio de 100 ps en el NVT y otra de 200 ps en el conjunto NPT. Haga clic o toque aquí para ingresar texto. Las dimensiones de las celdas XYZ de los sistemas de adalimumab son: 186,627 × 160,304 × 90,2284 Å (G0) y ​​185,041 × 161,404 × 90,1505 Å (G0F); para avelumab: 193,75 × 161,42 × 95,78 Å (G0) y ​​193,75 × 161,91 × 96,87 Å (G0F).

Se realizó una breve simulación de cmD de 50 ns de duración para los cuatro sistemas con AMBER2032 y CHARMM36 forcefield34, elegidos para investigar la dinámica de los azúcares con mayor precisión. Estas simulaciones se llevaron a cabo para obtener la energía potencial promedio (EPTOT) y la energía promedio del ángulo diédrico (DIHED), que se utilizaron como entrada para AMD, así como un sistema de entrada minimizado y equilibrado para ser utilizado en la fase de producción de AMD. . Los sistemas se prepararon utilizando CHARMM-GUI35 y se solvataron con una caja de agua cúbica de 181 Å × 3 dimensiones con una distancia mínima al borde de 15 Å y NaCl 0,15 M. La energía de cada sistema solvatado se minimizó durante 5000 ciclos con un algoritmo de descenso más pronunciado. , aplicando restricciones posicionales a las proteínas y azúcares y restricciones diédricas a los azúcares. La fase de equilibrio se realizó durante 125 ps en conjunto NVT (T = 300 K) con la dinámica de Langevin, el algoritmo SHAKE para restringir las vibraciones de los átomos de hidrógeno y la malla de partículas Ewald (PME)36 para calcular interacciones electrostáticas con un valor de corte. de 12 Å. A partir de estos sistemas equilibrados, se realizó una simulación de AMD de 1 µs de duración para cada anticuerpo. Para la fase de producción de AMD el paso de tiempo se fijó en 0,002 ps, la energía y las coordenadas se guardaron cada 100 ps, ​​se utilizó el conjunto NPT (T = 300 K; P = 1 bar) con una dinámica Langevin para el control de temperatura y un barostato Berendsen. para la presión, y todo el potencial fue impulsado junto con un impulso adicional a las torsiones (iamd = 3).

La Tabla complementaria 5 informa los valores de EthreshD, EthreshP, alphaD y alphaP utilizados como entrada para las simulaciones y calculados como en las siguientes ecuaciones37:

En las Tablas complementarias 6 y 7 se informa la configuración de los sistemas generados para simulaciones de cMD y AMD, respectivamente.

MDTraj38 calculó RMSD, RMSF y Rg en átomos de C-alfa. El análisis de cMD se realizó en las réplicas concatenadas de cada sistema excluyendo los primeros 300 ns que se consideraron pasos de equilibrio. El movimiento de los dominios Fab se describió mediante ángulos ϕ (longitud) y θ (latitud) definidos en un sistema de referencia unido a Fc y centrado en la bisagra con ejes definidos de la siguiente manera: eje z colineal a Fc y dirigido hacia Fabs, x Eje paralelo a un vector que une la mitad de Fc (regiones CH2) y el eje y definido por la regla de la mano derecha. Para una descripción más detallada ver el trabajo de Saporiti et al.20 Se eligió un umbral arbitrario de 85° para el ángulo θ para discriminar entre conformaciones en forma de Y y T. En concreto, consideramos que la única IgG1 humana completamente cristalizada (PDB ID: 1HZH)31, que está clasificada como conformación en forma de T39, presenta θ > 90° para ambos dominios Fab, y tomamos en cuenta también la variabilidad conformacional esperada. de simulaciones MD. La distancia entre los dominios CH2 se midió entre el Asn glicosilado usando MDTraj38. Luego, se produjeron diagramas de caja para evaluar la significancia estadística de los valores observados en los 21.000 fotogramas totales. Para el AMD, se aplicó un procedimiento de pesaje según los métodos descritos por Miao et al.40 utilizando la expansión de Maclaurin al décimo orden para aproximar la superficie de energía libre del sistema en función de los ángulos θ. Las matrices RMSD para el análisis de conglomerados (tanto de cMD como de aMD) se generaron con CPPTRAJ41, mientras que los conglomerados se obtuvieron utilizando un script personalizado basado en el algoritmo GROMOS42. En el caso de los anticuerpos se consideraron los átomos de C-alfa para el análisis, mientras que para los glicanos los oxígenos involucrados en los enlaces glicosídicos. Se utilizó un umbral RMSD de 7,5 Å y 6,5 Å para los anticuerpos en cMD y aMD, respectivamente, y el número máximo de grupos se estableció en 15 y 10, respectivamente. Para la agrupación de glicanos, el umbral de RMSD se estableció en 1 Å y el número máximo de agrupaciones en 10. La dinámica esencial (DE) se calculó en las trayectorias generales mediante la herramienta de análisis de covarianza de GROMACS 2020.120,43. Luego, las trayectorias resultantes, proyectadas a lo largo del primer y segundo vector propio, se filtraron por los marcos incluidos en el mínimo de energía identificado a partir del FES (calculado en función de los ángulos θ) y se utilizaron para calcular la distribución Δϕ. CPPTRAJ41 y la herramienta "nativecontacts" calcularon la distancia mínima entre las cadenas de glucanos con la opción "mindist", mientras que la distancia entre el centro de masa de cada cadena y ella misma se calculó con la herramienta "distancia". Para este último, las trayectorias fueron prealineadas sobre el Fc. CPPTRAJ41 calculó los contactos entre las LC y la región bisagra con la herramienta "nativecontacts", considerando átomos pesados ​​y una distancia umbral de 4 Å. El análisis de los enlaces de hidrógeno (enlaces H) se calculó mediante un script de Python personalizado basado en la herramienta de identificación de enlaces H MDTraj20.

Se realizaron tres réplicas de simulación de cMD para cada condición. Los análisis de las trayectorias de cMD se calcularon incluyendo los últimos 7000 fotogramas de cada réplica. Las réplicas se fusionaron para obtener un número total de fotogramas n = 21.000 por cada sistema. Los análisis de las simulaciones de AMD se realizaron en marcos de energía mínima, es decir, n = 2649 para adalimumab G0, n = 3440 para adalimumab G0F, n = 3170 para avelumab G0, n = 4110 para avelumab G0F. Para conocer la reproducibilidad de los análisis, consulte los datos de origen detrás de los gráficos en la Fig. 1 (a, b, d) y la Fig. 5 (a, b) incluidos en los Datos complementarios 1. Para conocer la reproducibilidad del estudio, consulte los archivos de entrada, las topologías y las coordenadas iniciales de los sistemas incluidos en los Datos complementarios 2.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementarios).

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Estos autores contribuyeron igualmente: Fabio Centola, Ivano Eberini.

Departamento de Ciencias Farmacológicas y Biomoleculares, Universidad de Milán, Via Balzaretti, 9, 20133, Milán, Italia

Simona Saporiti, Tommaso Laurenzi, Uliano Guerrini, Giulia Benigno, Luca Palazzolo, Omar Ben Mariem y Linda Montavoci

Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Milán, Sección de Química General y Orgánica “A. Marchesini”, Via Venezian, 21, 20133, Milán, Italia

Crescenzo Coppa

Programa de desarrollo biotecnológico, Merck Biopharma, Aubonne, Suiza

Lobo Palinsky

Innovación y ciencia farmacéutica analítica global, Merck Serono SpA, Roma, Italia

Mara Rossi y Fabio Centola

Departamento de Ciencias Farmacológicas y Biomoleculares y DSRC, Universidad de Milán, Via Balzaretti, 9, 20133, Milán, Italia

Ivano Eberini

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Correspondencia a Fabio Centola.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Rajarshi Roy y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Gene Chong.

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Reimpresiones y permisos

Saporiti, S., Laurenzi, T., Guerrini, U. et al. Efecto de la fucosilación del núcleo de Fc y el isotipo de cadena ligera sobre la flexibilidad de IgG1. Común Biol 6, 237 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04622-7

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Recibido: 03 de octubre de 2022

Aceptado: 21 de febrero de 2023

Publicado: 03 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04622-7

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